MUDr. Dana Maňasková


Vyhledávání na medicinman.cz
 

nemoci-sympt/BAKTERIALNI-INFEKCE/chlamydie/diagnostika

Electron microscope

  • Has made it possible to visualize the bacterium (Ladany S et al., 1989) [151]

Historie

  • The first C. pneumoniae isolates
    • From conjunctival cultures of children during trachoma vaccine studies in the 1960s
    • Not associated with eye infection [25]
  • Role as a human pathogen was not fully defined until 1983
    • First respiratory isolate was obtained
      • In yolk-sac cultures
        • Only method then available for isolation of Chlamydia
      • Were thought to represent strains of C. psittaci based on inclusion morphology [25]
  • Development of cell culture methods allowed further characterization
    • Characteristic pear-shaped elementary body
    • Surrounded by a periplasmic space
    • Morphologically distinct from the round elementary bodies of C. trachomatis and C. psittaci [25]
  • DNA homology studies
    • C. pneumoniae isolates have
      • Less than 5% DNA homology with C. trachomatis
      • Less than 10% with C. psittaci [25]
    • C. pneumoniae isolates are highly (> 95%) related to each other [25]
  • First strain or serovar of C. pneumoniae has been identified
    • Name TWAR (designation of two of the initial isolates, TW-183 and AR-39)
    • Is synonymous with C. pneumoniae [25]
  • 1999 a new taxonomic classification of Chlamydia pneumoniae was proposed
    • Chlamydophila pneumoniae
      • Proposal failed to encounter universal acceptance
      • Both names are currently in use by different authors [25]

Diagnostika

  • Reliable diagnosis of infection due to C. pneumoniae and investigation of its role in chronic diseases remain difficult
  • Presence of a chronic C. pneumoniae infection can possibly be diagnosed by:
    • Continuous presence of high IgG or IgA titers in sera
    • By the presence of antigen [99]
      • CpHSP60
    • Presence of DNA in the infected tissues [99]

Culture

  • Different cell lines
  • HL and Hep-2 have been found to yield the best results [25]
  • Successful culture of C. pneumoniae in a limited number of labs
  • Easy inactivation during transport
  • Low yield
  • Often requiring repeated blind passages
  • Lack of typical clinical manifestations and the culture-negative stage do not mean the microbe persistently existing in host body is an innocent bystander [99]


Antigen detection

  • Direct fluorescent antibodies on respiratory smears
    • Sensitivity cca 20–60% as compared to that of culture
    • Specificity should approach 95%
  • Highly operator dependent
  • Mostly employed for culture confirmation [25]

Histopatology

Atypical RBs

  • After antibiotic treatment
  • In reactive arthritis (Reiter’s syndrome) (TR)
  • In chronic prostatitis cases (TR) [1]
  • In macrophages from an aortic valve sample from chronic C. pneumoniae infection [1]



Serology

  • Majority of seroepidemiological studies were markedly limited
    • Use of single time point sampling of either IgG or IgA antibodies to define chronic infection
  • Currently no valid serological marker specifically for chronic C. pneumoniae infection
    • Interpretation of infection status on the basis of single titre readings was not recommended [14]
  • IgG titres
    • Considered to indicate past exposure [14]
  • Neither IgA nor any other marker
    • Is valid indicator of persistent infection [14]
  • Antibody titre samples necessary at more than one time point
      • Even with two samples, the possibility of re-infection, rather than chronic infection, cannot be excluded [14]
    • Enabled a more reasonable assumption of chronic infection
  • VD2 a VD3, regions of the MOMP of C. pneumoniae
    • Only recognized by C. pneumoniae-positive sera [17]
  • Průkaz protilátek proti C. pneumoniae (nepřímý průkaz mikroba)
    • Reakce vazby komplementu
    • Detekce specifických protilátek enzymovou imunoanalýzou
      • Monoklonálními protilátkami
      • Technikou tzv. western blotu [121]
  • Nejčastěji využívanou metodou k diagnóze infekce C. pneumoniae
  • V prvních 6–8 měsících věku dítěte
    • Možná přítomnost transplacentárně přenesených IgG protilátek z matky

Sledování protilátek

  • Sérologický průkaz akutní infekce
    • Nejméně čtyřnásobný vzestup hladiny IgG nebo IgA protilátek mezi párovými séry odebranými v odstupu několika týdnů
    • Titr IgM protilátek větší nebo roven 16 (MIF) je také považován za průkaz akutně probíhající infekce
  • Při primární infekci
    • IgM protilátky produkovány kolem 3. týdne po nástupu nemoci
    • IgG a IgA protilátky vznik až za cca 6–8 týdnů po nástupu onemocnění
  • Při reinfekci
    • IgM protilátky jen v nízkých titrech
    • IgG a IgA rostou rychle během 1–2 týdnů
      • Mohou dosáhnout i vysokých hodnot
  • Úzdrava
    • IgM
      • Počínají klesat v průběhu 2 měsíců
      • Mizí po 4–6 měsících
    • IgA protilátky mají také krátký poločas
    • IgG protilátky perzistují v organismu
      • Mohou být detekovatelné i déle než 3 roky
        • Zvláště starší nemocní, kteří prodělali vícekrát infekci C. pneumoniae, mohou mít perzistující vysoké titry IgG
  • Asymptomatická infekce
    • Protilátky signalizující aktivní infekci nacházíme poměrně často (asi ve 25 %) u zdravých osob – dárců krve
    • Nejčastěji se jedná o IgG a IgA pozitivitu [121]
  • Chronická infekce
    • Trvale elevované titry IgA protilátek (na rozdíl od IgG)
      • Považovány za marker chronické infekce
      • Studie prokazující souvislost progredující elevace protilátek proti C. pneumoniae a výrazných symptomů chronického respiračního onemocnění
  • Protilátky lze prokazovat i v cirkulujících komplexech
    • Jejichž trvalá přítomnost v oběhu je známkou perzistující infekce
  • Sérologie není adekvátním indikátorem chronické infekce C. pneumoniae
    • Není schopna zjistit, kde se nachází potenciální chronický proces
    • Vysoká frekvence výskytu protilátek proti C. pneumoniae v populaci ztěžuje průkaz souvislosti stadia onemocnění a hladiny protilátek

Komplementfixační reakce (KFR)

  • Detekující protilátky proti chlamydiálnímu LPS
  • Není schopna diferencovat jednotlivé druhy chlamydií
  • Hlavní přínos
    • Protilátky proti LPS chlamydií jsou produkovány při primární infekci velmi časně
  • Senzitivita KFR testu při primární infekci je kolem 60 %
  • Při reinfekci není KFR vhodnou metodou
    • Zachytitelné protilátky proti LPS jsou detekovatelné pouze raritně
    • Senzitivita dosahuje pouze 10 % [121]

Microimmunofluorescence (MIF) assays - přímé mikroimunofluorescence

  • Využívá monoklonálních protilátek specifických pro C. pneumoniae
  • Umožňuje detekci ET v různých vzorcích
  • se senzitivitou vyšetření 20–60 %
  • Vyšší je senzitivita u vzorků z hlubších oblastí [121]
  • Considered by the CDC to be the only currently acceptable serological test
  • Considered to be the reference standard for serodiagnosis
    • Despite significant limitations
  • Most convincing evidence of acute infection
    • IgM antibodies +
    • 4x rise in IgG antibodies
      • Need for paired sera to show 4x rise in antibody titres is a limitation [25]
  • In primary infections
    • IgM antibodies appear 2–3 weeks after infection
    • IgG antibodies appear 6–8 weeks after infection [25]
  • Re-infection
    • IgM antibodies may be absent
    • Or of low titre if present
    • IgG antibodies appear earlier
      • Within 1–2 weeks after infection [25]
  • Vysoké hodnoty protilátek proti C. pneumoniae detekované MIF
    • Mohou být někdy heterotopní
      • Infekci jiným druhem chlamydií
      • Jinými organismy jako Bartonella spp. či Bordetella pertussis [121]

ELISAs - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

  • S LPS rodově i druhově specifickými
  • LPS antigeny byly také metodou ELISA detekovány z cirkulujících imunokomplexů
  • Není snadná
  • Není tak citlivá jako detekce protilátek
  • Protilátky proti lipopolysacharidu chlamydií mohou zkříženě reagovat s jinými gramnegativními bakteriemi
  • Testy ELISA jsou rodově i druhově specifické
    • Schopné diferencovat jednotlivé třídy protilátek
  • Kity ELISA užívají jako antigen lipopolysacharid extrahovaný z ET nebo syntetické peptidy specifické pro C. pneumoniae
  • Testy ELISA umožňují plnou automatizaci provedení i analýzu údajů.
  • Dle rodově specifických metod ELISA lze prokazovat protilátky i v poměrně časné fázi onemocnění [121]

Amplifikované kity ELISA

  • Senzitivita se v porovnání s ligázovou nebo polymerázovou řetězovou reakcí pohybuje mezi 85–90 %
  • Při téměř stoprocentní specificitě [121]

Immunochromatographic test

  • Detection of C. pneumoniae-specific IgM antibodies
  • Sensitivity 100%
  • Specificity 92.9%
  • Detects only the IgM response
    • Usefulness may be limited to primary infection [25]

Mikroimunofluorescence

  • Byla dříve používána jako referenční metoda
  • Poměrně složitou a subjektivní metodu
  • Stanovuje protilátky proti C. pneumoniae za využití ET jako antigenu
  • Stanovuje druhově specifické protilátky tříd IgA, IgM a IgG
  • Podobně jako ELISA napomáhá v rozlišení primární infekce a reinfekce [121]


PCR

  • Major advantages
  • Successfully employed with respiratory specimens, lung and vascular biopsy specimens, and blood
  • More sensitive technique than culture
  • Limited number of commercially available tests
  • Lack of standardization
    • Extraction procedures
    • Primer definition, etc.
  • PCR je schopna detekovat i jen 10 ET
  • Vhodný vzorek k vyšetření zahrnuje
    • Nosohltanový sekret
    • Bronchoalveolární tekutinu
    • Sputum
    • Vykloktanou vodu
    • Krev a tkáň z biopsie či nekropsie
  • Možnost detekovat chlamydiální DNA u
    • Neinfekčních RT
    • Nekultivovatelných ET
  • Citlivější metodou než kultivace
  • Standardizace protokolu umožní
    • Nárůst automatizace vyšetření
    • Komerční využití diagnostických kitů [121]

Presence of chlamydial RNA and DNA

  • In culture-negative patients
    • Evidence of chronic chlamydial disease
    • Some form of persistence in clinical settings [1]

Nested PCR assays

  • Involve significant problems with contamination
  • May result in the overestimation of disease

Nested PCR PBMC analysis

  • 59% of CAD patients C.p. positive
  • 46% of middle-aged blood-donor controls C.p. positive
  • More useful tool than serology for the identification of C. pneumoniae carriers
  • C. pneumoniae in PBMCs
    • Indicator of current infection
    • Quickly cleared once infection has resolved
      • Although the bacteria may be harboured within monocytes in a persistent state [14]
  • The prevalence of infection ranged widely between studies
    • Is not clear whether this is attributable to
      • Real population differences
      • Differences in DNA extraction and PCR methodologies [14]
  • There is no standardized PCR assay for C. pneumoniae [14]

Real-time assays

  • Advantages over conventional assays
  • Real-time RT-PCR specific for C. pneumoniae 16S rRNA and propagation on HEp-2 cells [54]

A multiplex PCR

  • Allows simultaneous identification of C. pneumoniae, Legionella pneumophila and M. pneumoniae

Nucleic acid amplification test (NAAT)

  • Positive cases that are not detected by culture
  • NAATs are expensive, culture is certainly more [1]

Chlamydiální Hsp60

  • Téměř identický s Hsp60 E. coli
  • Blízký některým antigenním determinantům pikornavirů
  • Vzhledem k možným zkříženým reakcím je na místě použití
    • Western blotu jako doplňující sérologické metody vylučující zkřížené reakce protilátek [121]

Klinická reakce na terapii

  • Standard serological tests for Cpn are often false-negative in the face of actual infection
  • Often treatment response to an empirical course of CAPi treatment, when symptoms are suggestive for Cpn, is the best indicator of infection. [27]


Diferenciální diagnostika


Kultivace chlamydií v laboratoři

  • Stanovení citlivosti k ATB
  • Small differences in methodological approaches can further complicate the interpretation of in vitro resistance and its association with clinical relevance !!!

Problémy ovlivňující výsledek zkoumání

  • Cell line
  • Passage number of both host cells and Chlamydiae
  • Multiplicity of chlamydial infection
  • Developmental stage when antibiotic is added to the infected cells
  • Presence or absence of cycloheximide (used to slow growth of the host cells)

Attributes of chlamydial growth

  • Cellular uptake of antibiotics by host cells
    • Different models of polarized and nonpolarized cells
  • Different cell lines permit differential growth of chlamydia strains when exposed to the same concentration of AZM
    • AZM-resistant isolates from patients with relapsing infections
      • Cell line permissive to chlamydial growth in the presence of inhibitory concentrations of AZM

Clinical isolates

  • Extremely fastidious
  • Much slower growth rates
  • Increased potential for cytotoxicity or persistence
  • In very low numbers relative to the reference strains used as controls in MIC/minimum chlamydiacidal concentration assays
    • Specific percentages vary

Culture recovery rate

  • Particularly low from rectal samples
  • Modestly better from urine, cervical, oropharyngeal and other sites
  • Marginal sensitivity of culture-based diagnostics - specificity approaches 100%

Tkáňové kultury

Linie HeLa

  • Z rakoviny děložního čípku zemřelé Heleny Langeové [121]

Hep-2

  • Buňky lidského laryngeálního karcinomu [121]
O úroveň výše

Poslední aktualizace: 18. 12. 2022 1:29:36